Полимеразная цепная реакция или ПЦР — это метод создания тысяч копий цепи ДНК. Он использует способность ферментов полимеразы создавать копии генетического материала в лабораторных условиях.
ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) составляет основу бесчисленных исследований с участием живых организмов. Из кода ДНК мы можем определить генетическую основу заболеваний, разработать лекарства, провести судебно-медицинскую экспертизу, идентифицировать микробы и многое другое.
Самое главное, что нужно для такого исследования, — это большое количество исследуемого фрагмента ДНК. Однако ДНК, выделенной из клеток, тканей или любого другого биологического источника, часто бывает недостаточно для анализа. Таким образом, ученым нужно делать больше копий ДНК.
Именно здесь и проявляется решающая роль «полимеразной цепной реакции».
Что такое полимеразная цепная реакция?
ПЦР использует способность ферментов полимеразы создавать копии генетического материала в лабораторных условиях.
До появления ПЦР копии ДНК создавались путем выделения определенного фрагмента ДНК и вставки его в геном живых клеток. Живые клетки реплицировали вставленную ДНК, одновременно реплицируя свою собственную ДНК. Этот метод был трудоемким и длительным способом получения копий ДНК, достаточных для дальнейшего изучения.
Однако теперь это уже не так. Основная заслуга в этом принадлежит Кэри Маллису, который в 1983 году изобрел «полимеразную цепную реакцию» (ПЦР), положив начало «биотехнологической революции». Сегодня ПЦР является очень распространенной лабораторной техникой даже в небольших лабораториях и используется для создания копий ДНК на регулярной основе.
ПЦР может избирательно создавать копии интересующей ДНК посредством процесса, часто называемого «молекулярным фотокопированием». После синтеза нескольких копий ДНК с помощью ПЦР ДНК подвергается «амплификации».
Каковы компоненты реакции ПЦР?
Ключевыми компонентами реакции ПЦР являются матричная ДНК, праймеры, нуклеотиды и термостойкая ДНК-полимераза. Давайте кратко узнаем о каждом из этих компонентов.
Для ПЦР можно использовать ДНК от простейших бактерий до самых сложных животных и растений. Однако вся ДНК (шаблонная ДНК) не проходит ПЦР; в ходе процесса будет амплифицирована только небольшая часть.
Для амплификации ДНК очень важны праймеры — короткие участки нуклеотидов (примерно 20 п.н.). Используется набор праймеров, как прямой праймер, так и обратный праймер. Праймеры связываются с началом и концом цепей ДНК, сигнализируя о точках, из которых цепь ДНК должна быть амплифицирована.
Нуклеотиды, используемые для реакции ПЦР, представляют собой смесь всех четырех азотистых оснований, обнаруженных в ДНК. Это аденин (A), тимин (T), гуанин (G) и цитозин (C).
Последний и самый важный компонент — ДНК-полимераза. Фермент полимераза создает новые молекулы ДНК путем сборки нуклеотидов способом, который комплементарен существующей цепи. Таким образом, он может фактически создать две идентичные молекулы ДНК из одной нити ДНК.
Наряду с ферментом в реакционную смесь необходимо добавить кофакторы, необходимые для действия ДНК-полимеразы. Кофакторы — это металлические соединения, которые имеют решающее значение для активности ферментов. Ионы магния являются кофакторами ДНК-полимеразы.
ДНК-полимераза, используемая в ПЦР, представляет собой термостабильную ДНК-полимеразу (часто называемую полимеразой Taq), выделенную из термофильных организмов, способных выдерживать высокие температуры.
Каковы этапы реакции ПЦР?
Теперь, когда мы знаем все компоненты, необходимые для ПЦР, давайте проверим, какие три этапа включает в себя реакция ПЦР. Эти этапы — денатурация, отжиг и удлинение.
Активность полимеразы зависит от наличия одноцепочечной ДНК, с которой могут связываться праймеры. Этого можно добиться, нагрев образец ДНК при температуре 94-98 °C.
Нагревание разрушает связи, удерживающие две нити ДНК вместе. Этот процесс называется денатурацией, так как двухцепочечная молекула ДНК денатурируется до двух одноцепочечных молекул. Одна нить ДНК будет называться нитью шаблона, а ее пара — комплементарной нитью.
На следующем этапе праймеры связываются (отжигаются) с шаблонной ДНК в определенных местах. Прямой праймер связывается с началом шаблонной ДНК (одна нить двухцепочечной ДНК) на 3 п.н. нуклеотидной последовательности ATG (стартовый кодон). Обратный праймер связывается с концом комплементарной ДНК (второй нити двухцепочечной ДНК) на 3 п.н. нуклеотидных последовательностей TAG, TAA или TGA (стоп-кодоны). ДНК между стартовым и стоп-кодонами амплифицируется.
Успех этого этапа зависит от последовательности праймеров и температуры, выбранной для отжига, обычно 50-65 °C.
Последним и завершающим этапом является элонгация или терминация, которая происходит при 72 °C, оптимальной температуре для активности Taq-полимеразы. ДНК-полимераза распознает связанный с праймером участок ДНК и добавляет нуклеотиды, комплементарные нити шаблонной ДНК. Это происходит до тех пор, пока она не встретит второй праймер.
После успешной реакции терминации вместо одной спирали ДНК, использовавшейся на начальном этапе, образуются две спирали ДНК. В каждой из двух спиралей ДНК одна нить будет исходной нитью, полученной из образца ДНК. Другая нить будет комплементарной нитью, синтезированной ДНК-полимеразой в ходе ПЦР.
Три этапа реакции ПЦР — это денатурация, отжиг и удлинение или терминация.
В чем заключается принцип амплификации ДНК с помощью ПЦР?
Этапы денатурации, отжига и полимеризации составляют один цикл ПЦР. Типичная реакция ПЦР может потребовать 25-35 циклов для оптимальной амплификации ДНК.
В конце одного цикла из одного шаблона ДНК образуются две молекулы ДНК. В конце двух циклов две ДНК образуют четыре молекулы ДНК, которые затем амплифицируются до восьми молекул ДНК в конце трех циклов. В конце n циклов будет 2n копий исходного шаблона ДНК.
После каждого цикла количество молекул ДНК, которые могут служить шаблонами для следующего цикла, увеличивается экспоненциально. Это увеличение числа шаблонов цикл за циклом является основой амплификации молекул ДНК в ПЦР.
Экспоненциальная амплификация молекул ДНК с помощью метода ПЦР
Каковы плюсы и минусы ПЦР?
Основные плюсы метода ПЦР заключаются в том, что он способен создавать миллионы и миллиарды копий ДНК всего за несколько часов. Этот метод быстр, относительно прост в освоении и может быть выполнен в базовых лабораторных условиях.
Основным недостатком является высокая чувствительность метода, поэтому образец, используемый для амплификации, должен быть свободен от загрязнений. Даже небольшие следы нежелательной ДНК могут амплифицироваться вместе с интересующей ДНК, что дает ложные результаты.
Другим недостатком является требование информации о последовательности ДНК для разработки праймеров. Кроме того, праймеры могут иногда отжигать не на тех участках ДНК. Такой неспецифический отжиг праймеров может привести к амплификации неправильного фрагмента ДНК.
В редких случаях ДНК-полимераза может включить неправильное основание, что приведет к изменению последовательности интересующей ДНК, что может повлиять на последующий процесс.
Для успешного проведения реакции ПЦР необходимо иметь чистый генетический материал, соответствующий набор праймеров и подходящую температуру отжига.
Где можно использовать эту технологию?
Основное применение ПЦР — это селективное выделение ДНК из смешанных образцов ДНК. Это может помочь диагностировать инфекционные заболевания, генетические заболевания и несколько видов рака за короткий промежуток времени. Он также используется в криминалистике для идентификации преступников и проверки родства.
Он составляет основу большинства приложений, связанных с молекулярной биологией, клонированием генов, технологией рекомбинантной ДНК и мутагенезом.
Практическое развитие простой и универсальной техники ПЦР, предложенной Кэри Маллис, радикально изменило биологические исследования. Все, что нам нужно сделать, это смешать все компоненты ПЦР в соответствующих концентрациях в маленькой пробирке, загрузить ее в ПЦР-машину (термоциклер) и подождать несколько часов. После периода ожидания исследователи получат от миллионов до миллиарда копий интересующей вас ДНК. Разве это не удивительно?
Вот почему ПЦР всегда будет быстрым и надежным методом создания копий ДНК по сравнению с методами, использовавшимися до этого революционного открытия.
Источник:
